Тести для визначення групи крові у котів RapidVet-H Feline

Визначення групи крові у котів in vitro

Швидкі тести для визначення групи крові у котів RapidVet-H Feline

Опис

Як показує практика, в останні роки у ветеринарній трансфузійній медицині значення визначення груп крові у кішок і собак значно зросло.

Зокрема попит на визначення групи крові знаходиться на підйомі тому, що тільки визначивши наперед групу крові реципієнта можна уникнути смертельної помилки при переливанні крові. У кішок зустрічаються три групи крові, що позначаються як А, В і AB. Антигени кішок не мають ніякого відношення до антигенів людини АВО і визначаються по котячій алоімунній сироватці. Групи крові варіюються між породами. У кішок одна система груп крові, що складається з двох антигенів, комбіновано або окремо: А, В і AB. Групи крові у кішок успадковуються аутосомно за простими ознаками з домінуванням групи А над групою В. Більшість кішок мають А антиген і близько однієї третини з них, що зустрічаються в природі, мають анти-В антитіла. Група В у всіх, що зустрічаються в природі, кішок має високий титр анти-А антитіл. Недавнє опитування проведене в Сполучених Штатах показало, що відсоток кішок з антигеном В варіюється від 0,3% до 59% в залежності від породи.

Кішки з групою крові АВ рідкісні, оскільки такі кішки на мембранах еритроцитів мають обидва антигени: А і В, вони не мають або мають тільки анти-А, або тільки анти-В антитіла. Визначення груп крові у кішок грає важливу роль в практичній ветеринарній медицині для запобігання змішування А і B еритроцитів. Кішки з B еритроцитами демонструють негайну і катастрофічну системну анафілактичну реакцію (гіпотензія, брадикардія, апное, сечовипускання, дефекація, блювота і важка неврологічна депресія), а також гемолітичні ознаки (гемоглобінемія і гемоглобінурія), коли переливають кров групи А через їх природного високого титру анти-А антитіл. Кішки з А еритроцитами і природними антитілами з низьким титром анти-B антитіл будуть мати слабку реакцію, при змішуванні з B кров'ю, але навіть це може вплинути на швидкість відновлення організму при медичному випадку, так як еритроцити, що переливаються, мають короткий термін життя. Інші кішки з А еритроцитами, яким кров групи B переливається вперше, реакцію не виявляють, але, як наслідок, у них буде розвиватися помірний титр анти-B антитіл, який призведе до серйозної негативної реакції при подальшому суперечливому переливанні. Визначення групи крові у кішок також має важливе значення при схрещуванні, це дає розуміння про можливі проблеми у кошенят. Неонатальний гемоліз може статися, коли є несумісність групи крові матері і плоду. У порід кішок з групою В, що часто зустрічається в природі, і високим титром анти-А антитіл, неонатальний гемоліз може статися у кошенят з групою крові А в результаті схрещування самки з групою крові В і самцем з групою А. Материнські анти-А антитіла з молозивом поглинаються кошеням і активно руйнують його еритроцити. І здорові при народженні кошенята гинуть протягом перших днів життя. Визначення груп крові у кішки і кота, а також підбір сумісності, можуть виключити гемоліз новонароджених кошенят.

RapidVet-H (Feline) призначений для визначення у кішок групи крові А, групи В і групи АВ. Антисироватка ліофілізована на Тестових Картах, добре розбавляється і змішується з цілісною кров'ю пацієнта. Всі групи А еротроцітів реагують з певною антисироваткою і викликають реакцію аглютинації; група В еритроцитів проявляється зі своєю специфічною антисироваткою; всі групи АВ еритроцитів викликають аглютинацію у всіх випадках. Характер аглютинації в тестовому полі «А» і в тестовому поле «В» значно відрізняються один від одного через різної природи використовуваної антисироватки.

Принцип проведення аналізу

The RapidVet-H (Feline) аналіз заснований на реакції аглютинації, яка відбувається тоді, коли еритроцити, що містять на поверхні мембрани одну з груп A, B або AB антигенів взаємодіють з висушеною антисироваткою специфічного антигену, нанесеного на тестове поле картки.

Тип A еритроцитів характерний для NeuGc2GD3, що утворює гліколіпідний антиген на поверхні мембрани. RapidVet-Н (Feline) використовує мишачі моноклональні антитіла, які доводять специфічність для даного антигену, лиофілізованого на тестовій карті. Молекула антитіла дає йому здатність до зв'язування і склеювання антигенів, специфічних для крові групи А.

Тип В еритроцитів характерний для NeuAc2GD3 і має вигляд нейрамінової кислоти, представленої гангліозидою і відсутністю NeuGc, що присутній в групі А еритроцитів. Специфічною сполучною ланкою був виявлений лектин Triticum Vulgaris. RapidVet-Н (Feline) використовує лектин Triticum Vulgaris для виявлення групи крові В.

Увага: певна кількість котячих пацієнтів демонструє автоаглютинацію різного ступеня, зумовлену різними факторами, які викликають аглютинацію з власними червоними тілами. Якщо пацієнт демонструє автоаглютинацію під час тесту, то визначити групу крові буде неможливо без сепарування сироватки і промивання еритроцитів перед тестом. Червоні кров'яні тільця промиваються центрифугуванням на швидкості 2000 обертів/хв протягом 5-ти хвилин. Після центрифугування отримують рідку частину (плазму) у верхній частині і тверду частину (еритроцити) в нижній. Оператор повинен зібрати рідку частину і замінити її таким же об'ємом фізіологічного розчину. Потім оператор повинен знову перевірити зразок, чи з'явиться ще реакція автоаглютинаціі. Якщо це так, то він повинен знову повторити процедуру промивання. 

Реагенти та матеріали:

Тестова картка аглютинації. Кожна картка має 3 тестових поля. Картка містить у собі "Auto-Agglutination Saline Screen" і два поля ''Patient Test'' - група A і "Patient Test" група В. Всі карти упаковані індивідуально і запаковані в поліетиленові пакети які містять вологопоглинач. Зберігати при кімнатній температурі або в холодильнику (+2 +8 °C).

Пляшка з розчинником. Прозорий пластиковий флакон містить 0,02 моль/дм3 фосфатний буферний розчин (PBS) з рН 7,4. Наконечник пропускає по 50 мкл в одній краплі. Зберігати при кімнатній температурі або в холодильнику (+2 +8 °C).

Піпетки і мішалки. Кожен поліетиленовий пакет містить пластикові піпетки і мішалки.

Зберігання та стабільність:

1. Тестова карта аглютинації залишається стабільною при кімнатній температурі (+20 +25 °C) протягом 18 місяців від дати виробництва. Кожна картка має дату виходу терміну придатності. Зберігання в холодильнику (+2 +8 °C) не продовжує термін придатності істотно, але і негативного впливу на якість аналізу не робить. Але може виключити непередбачені або невідомі коливання кімнатної температури за межі допустимого діапазону.
2. Розріджувач стабільний протягом 24 місяців з дати виготовлення. Кожна пляшка маркована датою закінчення терміну придатності.
3. Якщо тест проводиться правильно, то хоча б в одному тестовому полі з написом "Patient Test" пройде реакція аглютинації. Таким чином, тест пройшов самоконтроль.

Примітка: на кожному RapidVet-H (Feline) тестовому наборі вказана дата закінчення терміну придатності, в якому враховується найраніше закінчення терміну придатності компонента в наборі. Навіть якщо деякі компоненти мають більш пізні дати закінчення індивідуального терміну придатності, їх використання з компонентами з інших наборів не рекомендується.

Процедура проведення тесту:

1. Наберіть мінімум 0,4 мл крові пацієнта в шприц або піпетку з/або ЕДТА, як антикоагулянту. Аналіз вимагає 150 мкл крові.
2. Напишіть на картці ім'я/номер кішки і дату проведення тесту.
3. Покладіть тестову картку на плоску поверхню.
4. Нанесіть 1 краплю розчинника (50 мкл) з пляшечки з дозатором в область «Auto-Agglutination Saline Screen».
5. Наберіть невелику кількість зразка крові в піпетку і нанесіть 1 краплю (50 мкл) у область «Auto-Agglutination Saline Screen». Використовуйте мішалку для змішування матеріалів по всій поверхні тестового поля протягом 10 секунд. Мішалку тримайте весь час рівно притиснутою до поверхні тестової карти (дивіться інструкцію з користування піпеткою).
6. Існує невеликий відсоток кішок, що мають автоаглютинацію. Якщо спостерігається аглютинація, призупиніть проведення тесту і перш ніж продовжити, виконайте процедуру промивання червоних кров'яних тілець.
7. Нанесіть з пляшечки з дозатором в кожне тестове поле 1 краплю розчинника (50 мкг), що залишився. Розріджувач допомагає в реконструкції ліофілізованого матеріалу.
8. Акуратно збовтайте пробірку зі зразком крові пацієнта, щоб вся її внутрішня поверхня покрилася кров'ю для розчинення антигенів на її стінках.
9. Наберіть невелику кількість зразка крові пацієнта в піпетку і нанесіть по 1 краплі (50 мкг) в кожне з 2 теcтових полів з написом "Patient Test". Використовуйте мішалку для змішування матеріалів з вмістом кожного поля протягом 10 секунд. Мішалку тримайте весь час рівно притиснутою до поверхні тестового поля. Для кожного тестового поля використовуйте окрему мішалку.
10. Додайте другу краплю розчинника в тестове поле "Type A". Повторно не перемішуйте.
11. Покачайте тестову картку вздовж осі протягом 2 хвилин, переконайтеся, що матеріал "обертається" кожен в своєму полі. Будьте обережні, не змішайте зразки між собою.
12. Нахиліть карту під кутом 10-20°, щоб надлишок в крові зтік до нижньої частини тестового поля. Матеріалу, що залишився у верхній частині тестового поля буде досить для оцінки результату.
13. Прочитайте результат, зверніть увагу на поля, де сталася аглютинація.
14. Після того, як матеріали на картці висохли, наклейте на карту плівку для збереження результату.

Примітка

Використання піпетки: утримуйте піпетку між великим і вказівним пальцями біля плоского, закритого кінця, стисніть і не відпускайте. Утримуйте піпетку вертикально і помістіть відкритий кінець піпетки нижче поверхні зразка. Розтисніть піпетку для втягування зразка. Потім утримуйте піпетку в перпендикулярному положенні безпосередньо над тестовим полем, куди повинен бути нанесений зразок крові. Легенько стисніть і нанесіть краплю на тестове поле (50 мкг). Для компенсації втрати матеріалу, що залишається на мішалці, кожна піпетка має об'єм трохи більше 50 мкг. Використовуйте для кожного зразка нову піпетку. Ні в якому разі піпетка не повинна бути використана більш ніж один раз, в іншому випадку може статися змішування матеріалів тестових полів і результати тесту будуть недостовірними.

Результати

• Якщо аналіз пройшов правильно, має бути видно аглютинацію хоча б в одному з тестових полів з позначкою "Patient Test".
• Якщо аглютинація добре видна в тестовому полі для групи А, то тестована кров має групу А.
• Якщо аглютинація добре видна в тестовому полі для групи В, то тестована кров має групу В.
• Якщо аглютинація добре видна в обох тестових полях, то тестована кров має групу АВ.
• Потрібно враховувати, що при будь-якому тесті реакцію аглютинації буде видно через 2 хвилини.
• Характер аглютинації в тестовому поле B відрізняється від реакції в поле А.
• Аглютинація в тестовому поле А, як правило, включає в себе невелику кількість великих кульок.
• Аглютинація в тестовому поле В, як правило, у вигляді невеликих дискретних скупчень, кожна як головка шпильки.
• Якщо пацієнт анемічний і якщо пацієнт має групу крові А, то антиген може стати насиченим антитілами і перешкоджати перехресному зв'язуванню і аглютинації.
• Якщо пацієнт має низький гематокрит (НСТ), то це може допомогти в проведенні тесту, проводячи його без використання розчинника в тестових полях (А і В).

Інтерпретація результатів

Позитивна аглютинація
Негативна аглютинація

Обмеження

1. Для отримання точних результатів важливо чітко слідувати інструкції.

2. Завжди використовуйте нову дозуючу піпетку для кожного зразка і нову мішалку для кожного тестового поля. Повторне використання будь-якого приладу викличе контамінації та неточні результати.

3. Стабільність окремих компонентів набору змінюється. Зберігайте компоненти, як зазначено на етикетках. Не використовуйте компонент терміном придатності, що вийшов. Використання прострочених матеріалів може привести до отримання недостовірних результатів.

4. Розбавник представлений в пляшці з кришкою, що загвинчується, щоб мінімізувати ненавмисне бактеріальне або інше забруднення. Розріджувач не повинен використовуватися ні для чого крім проведення тесту на визначення групи крові.

5. Фізична цілісність зразка пацієнта має вирішальне значення для коректності результату.

6. Завжди набирайте повний шприц або пробірку де використовується ЕДТА. Менша кількість крові викличе занадто високу концентрацію ЕДТА в тестованій пробі.