ИФА тест система для диагностики АТ к вирусу лейкоза КРС, 10 плашек, 960 реакций

ИФА тест система для диагностики АТ к вирусу лейкоза КРС, 10 плашек, 960 реакций

Набор ИФА (блокирующий вариант) для определения антител специфичных к вирусу лейкоза КРС в сыворотке крови коров или молоке

Диагностический набор базируется на методе блокирующего ИФА, основанного на использовании двух МаТ к вирусному гликопротеину gp51. Тест-система позволяет определять антитела к вирусу лейкоза КРС в сыворотке крови и молоке КРС.

Суть метода:

Полистироловые планшеты покрыты gp51, которые адсорбированы на планшете с помощью 2х специфических антител к вирусному протеину gp51. После добавления образца в лунку, если в нем содержатся специфические антитела к вирусу, они прикрепятся к антигену. Если мы добавим специфическое МаТ к вирусному антигену, который находится на планшетах (конъюгтрованное пероксидазой), то оно вступит в реакцию с антителами в сыворотке. Если сыворотка содержит специфические антитела, они не допустят прикрепления маркированных МаТ к антигену. После промывания, чтоб смыть все не закрепленные материалы, можно определить присутствие/ отсутсвие маркированных МаТ, с помощью добавления субстрата ТМВ, в случае присутствия пероксидазы происходит колориметрическая реакция, которую можно измерить с помощью спектрофотометра.

Состав набора

Необходимые материалы, которые не входят в состав набора

• Дистилированная вода.
• Микропипетки от 5 до 200 μl.
• Одноразовые наконечники для пипеток.
• Устройство для промывки планшет.
• Пробирки 50-250 мл.
• Ридер ИФА 450 нм.

Меры предострожности:

1. Внимательно прочитайте инструкцию.
2. Все реагенты должны быть нагреты до комнатной температуры (20-250ºС).
3. Не смешивайте инструкции, а также реактивы из разных наборов.
4. Избегайте загрязнения реагентов набора.
5. Не используйте реагенты с различными номерами партий, а также реагенты из различных наборов.
6. В помещении не ешьте, не курите и не пейте.
7. Не пипетировать ртом.
8. Используйте новый наконечник для каждого образца сыворотки.
9. Субстрат раствор и субстрат буфер следует использовать с осторожностью.
10. При использовании набора каждый раз используйте новый раствор субстрата.
11. При использовании набора, позитив и негатив контрольные сыворотки должны быть использованы систематически.

Хранение реактивов

Хранить все реактивы при температуре +4ºC.

Останавливающий раствор может иметь осадок, если это произошло, нагрейте раствор до 37ºC перед использованием.

Промывание

Промывание может осуществляться с помощью автоматического промывателя или многоканальной пипетки, которая может распределить 300 μl жидкости в каждую лунку.

После инкубации, промывание следует осуществлять, соблюдая следующее:

• Вылить содержимое планшета резким движением, чтоб избежать попадания жидкости из одной лунки в другую.
• Распределить 300 μl жидкости в каждую лунку.
• Аккуратно потрясти планшет, избегаю контакта содержимого лунок между собой.
• Резким движением опустошить планшет.
• Повторять промывание столько раз, сколько указано в инструкции к набору.
• Прежде чем вылить содержимое лунок в последний раз убедитесь, что следующий реагент, который вы будете добавлять готов к использованию.
• После последнего промывания планшет обернуть бумагой для устранения лишней жидкости

Подготовка образцов

Для исследования используется сыворотка крови или молоко КРС как индивидуальные, так и пуловые образцы (10 образцов сыворотки). Если используются образцы молока, то с них рекомендуется снять пену.

Подготовка реагентов

• Промывающий раствор

Разбавить одну часть концентрированного промывающего раствора, который входит в набор, 24 частями дистиллированной воды (40 мл концентрированного раствора и 960 мл воды). Раствор остается стабильным при температуре +4ºC.

• Контрольная сыворотка

Контрольную сыворотку необходимо разводить так же как и образцы, добавляя по 50 μl контролей в каждую лунку + 50 μl разбавителя. После вскрытия они стабильны в течении месяца при +4ºC, для долгого хранения рекомендуется сделать аликвоты и хранить при -20ºC.

• Подготовка конъюгата: непосредственно перед использованием

Разведите необходимое количество конъюгата, который входит в набор с разбавителем, в пропорции 1/100. . Например, 110 μl конъюгата в 11 мл разбавителя для конъюгата, этого количества будет достаточно для 1 планшета 96 лунок. 10 μl конъюгата в 1 мл разбавителя для конъюгата, этого количества будет достаточно для 1 стрипа.

Процедура постановки исследования

1. Все реактивы необходимо выдержать в комнатной температуре перед исследованием (кроме конъюгата).
2. Добавьте 50 μl разбавителя во все лунки планшета. Добавьте по 50 μl позитив контроля, негатив контроля и образца в оставшиеся лунки. При такой схеме вы будете проводить исследование в разведении ½. Встряхните планшет. Контрольные сыворотки рекомендуется дублировать. Закройте клейкой пленкой и инкубируйте 1 час при 37ºС (± 3ºС).
3. Промойте каждый планшет 3 раза, соблюдая процедуру промывания.
4. Добавьте 100 μl конъюгата, подготовленного как описано выше, в каждую лунку. Заклейте пленкой и инкубируйте 30 минут при 37ºС.
5. Промойте каждый планшет 4 раза, соблюдая процедуру промывания.
6. Добавьте 100 μl раствора субстрата, подготовленного как описано выше, в каждую лунку. Оставьте при комнатной температуре на 10 минут в темном месте.
7. Добавьте 100 μl останавливающего раствора в каждую лунку, в таком же порядке как вы добавляли субтсрат.
8. Посчитайте ОП при 450 нм.

Чтение и интерпретация результатов

Тест считается достоверным если ОП НК выше ОП ПК более, чем в 5 раз

• ОП НК / ОП ПК > 5.
• ОП НК выше, чем 1.

Интерпретация

• Cut off негативный = НК — [(НК-ПК) х 0,4].
• Cut off позитивный = НК — [(НК-ПК) х 0,5].

Для скрининга:

• Образцы, у которых оптическая плотность ниже, чем значение позитивного cut off, считаются положительными к вирусу лейкоза.
• Образцы, у которых оптическая плотность выше, чем значение негативного cut off, считаются отрицательными к вирусу лейкоза.
• Образцы, у которых оптическая плотность между значениями cut off, считаются сомнительными. Рекомендуется повторить исследование через 3 недели.

Например:

Валидация

НК/ПК = 11,3 > 5

НК = 1,750 > 1

Cut off негатив = 1,750 — [(1,750-0,154) х 0,4] = 1,111

Cut off позитив = 1,750 — [(1,750-0,154) х 0,5] = 0,952

Образец 1 = положителен к вирусу лейкоза КРС.

Образец 2 = отрицателен к вирусу лейкоза КРС.